۱. مرحله حساس شدن
۲. اضافه کردن معرف کومبز
کومبز مستقیم
از کومبز مستقیم برای شناسایی آنتی بادی های ناقص متصل به RBC جنین استفاده می شود . تفاوتی که بین کومبز مستقیم و غیر مستقیم وجود دارد این است که، مرحله حساس شدن گلبول های قرمز در بدن جنین اتفاق می افتد. عامل اصلی حساس شدن RBC (در ۷۵ % موارد) ناسازگاری گروه های خونی RH میباشد هر چند که گروه های خونی ABO در ۲۵ درصد موارد هم می توانند باعث حساس شدن RBC شوند.
ناسازگاری RH
اگر خون جنین+Rh و خون مادر -Rh باشد آنتی بادی های تولید شده از کلاس Igg در بدن مادر از جفت عبور کرده و باعث حساس شدن RBC های جنین می شود.
ناسازگاری ABO
این ناسازگاری زمانی باعث حساس شدن RBC می شود که گروه خونی مادرO و گروه خونی جنین AB باشد در این صورت آنتی بادی 3Igg آنتی AB موجود در سرم مادر به جنین منتقل شده و باعث حساس شدن RBC جنین می شود.
روش انجام تست کومبز مستقیم
خون بند ناف را گرفته و از آن سوسپانسیون ۵ درصد گلبول های قرمز تهیه می کنیم. چون مرحله حساس شدن RBC در بدن جنین اتفاق افتاده است بنابراین نیازی به انکوبه کردن نیست.
۰/۱ میلی لیتر از سوسپانسیون ۵ درصد RBC را به ۱/۰میلی لیتر AHG اضافه می کنیم و برای تشکیل شبکه بین RBC، لوله های تست را به مدت ۳ تا ۵ دقیقه در دمای آزمایشگاه نگه می داریم. بعد از ۵ دقیقه، لوله ها را در۱۰۰۰ و به مدت یک دقیقه سانتریفیوژ می کنیم. در آخر هم لوله ها را از نظر آگلوتیناسیون با زدن ضربه ای ضعیف به لوله، بررسی می کنیم.
بررسی نتایج
اگر آگلوتیناسیون مشاهده شود، نشان دهنده حساس بودن RBC جنین است و باید تعیین تیتر شود (که در این تعیین تیتر، AHG را رقیق می کنیم نه سرم را) چون در زایمان دوم به بعد باعث HDN در نوزادان می شود.
کومبز غیر مستقیم
از کومبز غیر مستقیم برای شناسای RBC حساس شده در محیط In vitro استفاده می شود. مرحله حساس شدن RBC ها در این روش توسط انکوباسیون انجام می شود. مراحل بعدی تقریبا مشابه کومبز مستقیم است. در این تست آنتی بادی های ناقص، در خون مریض (مادر) وجود دارد. این آنتی بادی ها به دو علت عمده ممکن است تولید شوند:
۱. انتقال خون
۲. زایمان اول
برای بررسی وجود و یا عدم وجود این آنتی بادی، از سوسپانسیون ۵ درصد RBC، گروه خونی +O استفاده می شود. چون آنتی بادیهای ناقص، شاخص های آنتی ژن RBC های گروه خونی +O را حساس و با اضافه کردن AHG باعث ایجاد آگلوتیناسیون می شود.
علت استفاده از +O
برای اینکه ناسازگاری گروه های خونی ABO را از بین ببریم از این گروه خونی استفاده می کنیم چون اگر گروه های خونی A,B,AB استفاد شود، در این صورت ممکن است آنتی بادی ضد AB گروه خونی O باعث حساس شدن سوسپانسیون شود.
و علت اینکه از +RH استفاده می کنیم این است که می خواهیم آنتی بادی های ناقص بر روی آنتی ژن های +RH بشیند و بتوانیم آگلوتیناسیون را مشاهده کنیم. اگر -RH باشد در روی RBC، آنتی ژنی وجود نخواهد داشت تا RBC توسط آنتی بادی حساس شود.
روش انجام تست کومبز غیر مستقیم
۰/۱ میلیمتر از سرم بیمار را با ۱/۰ میلیمتر از سوسپانسیون ۵ درصد مخلوط می کنیم و سپس لوله آزمایش را به مدت ۳۰ تا ۴۰ دقیقه در انکوباتور ۳۷ درجه قرار می دهیم در این مرحله RBC در صورت وجود انتی بادی ناقص در سرم، حساس خواهند شد. بعد از این مدت، لوله آزمایش را به مدت یک دقیقه در دور ۱۰۰۰ سانتریفیوژ می کنیم. و سه بار توسط سرم فیزیولوژی شستشو می دهیم تا آنتی بادی های غیر اختصاصی حذف شوند و فقط آنتی بادی های اختصاصی که به شاخص های انتی ژنی RBC چسبیده اند، باقی بمانند. بعداز این مراحل یک قطره AHG به لوله اضافه می کنیم و بعد از ۳ تا ۵ دقیقه لوله را به مدت یک دقیقه در دور ۱۰۰۰ سانتریفیوژ می کنیم و در آخر هم با زدن ضربه ای ضعیف آگلوتیناسیون را برسی می کینم.
بررسی نتایج
اگر آگلوتیناسیون مشاهده شود تست کومبز غیر مستقیم بیمار را مثبت گزارش می کنیم.
چند نکته:
۱- قبل از انکوبه با اضافه کردن دو قطره آلبومین می توان آگلوتیناسیون را بهتر بررسی کرد.
۲- اگر بعد از انکوبه، آگلوتیناسیون مشاهد شود نشان دهنده این نکته است که در سرم ما آنتی بادی کامل وجود دارد و در واقع Back Type را انجام داده ایم.
۳- برای بررسی آگلوتیناسیون بهتر است از میکروسکوپ استفاده کنیم.
روش تهیه سوسپاسیون ۵ درصد
۲ قطره خون داخل لوله آزمایش می ریزیم. ۳ میلی لیتر سرم فیزیولوژی به لوله اضافه می كنیم و در سانتریفیوژ در دور ۳۰۰۰ به مدت ۵ دقیقه قرار می دهیم سپس مایع رویی را خالی كرده و این كار را تا ۳ بار تكرار می كنیم.
تبادل
لینک هوشمند